诊断弓形虫病依靠血清学检查。在疾病的最初2周出现特异性IgM抗体，在4~8周内出现高峰，然后在数月内下降直至测不到。IgG抗体上升较缓慢，1~2个月后达高峰，并可在稳定的高水平上持续数月至数年。
出现IgM抗体或IgG升至4倍，常表明为急性感染。若淋巴结肿大的孕妇或免疫受损脑炎病人的IgG免疫荧光试验或染色试验的滴度>1：1000阳性，也应怀疑急性感染。能防止再感染的过去的感染，其典型的血清学结果是IgG阳性而IgM阴性。
新生儿疾病时测到特异性IgM抗体表明为先天性感染(母亲的IgG能通过胎盘而IgM不能)。活动性脉络膜视网膜炎时，可测到低滴度的IgG抗体但不能测到特异性IgM。
血清学对诊断艾滋病者的弓形虫病帮助不大，在重新激活时不出现IgM抗体，而抗弓形虫IgG抗体不能区别隐性感染还是再激活的感染。在美国，艾滋病患者不论是否存在有临床症状的弓形虫病，他们的IgG阳性率为20%~30%。
用急性期的活检材料或体液接种小鼠或组织培养可分离得到弓形虫，但该法需要6个星期的时间。组织学检查也可发现虫体，急性感染时的速殖子用吉姆萨或赖特染色效果很好，但常规的组织切片染色很难找到虫体。
组织包囊不能区别急性和慢性感染。弓形虫还必须与组织胞浆菌，克氏锥虫和利什曼原虫等其他细胞内病原体区别。快速测定血液，脑脊液和羊水中的弓形虫抗原或经PCR扩增的DNA的诊断试验尚在研究中。用PCR技术分析羊水似乎是诊断胎内弓形虫病最敏感的方法。
中枢神经系统弓形虫病时，脑脊液中淋巴细胞增多，蛋白含量增加。典型的CT扫描可见多发性致密的圆形病变，使用对比剂时可形成环状增强的病变。磁共振比CT更敏感。
虽然这些病变无诊断特征性，但艾滋病伴中枢神经系统症状的病人出现这种CT或磁共振影像变化可作为施行经验治疗的依据。若弓形虫病的可疑诊断是正确的，则7~14日内临床及放射学均可获明显改善。对艾滋病患者的中枢神经系统弓形虫病的特异性诊断需求助于脑活检。
